15 (27) июля 1834 состоялось торжественное открытие университета. 18 (30) октября 1834 на должность первого ректора Университета утверждён профессор Михаил Максимович.
В первом учебном году (1834-1835) в университете работал лишь один философский факультет с двумя отделениями: историко-филологическим и физико-математическим. На первый курс были зачислены 62 студента и 28 августа 1834 г. в университете начались занятия.
Под руководством профессора архитектуры В. И. Беретти возвели огромный университетский корпус (1838—1842). В 1842 г. университет переехал в новое здание, где помещался до 1917 года.
Университет первоначально был учрежден в составе 2-х факультетов: философского (позднее разделённого на историко-филологический и физико-математический) и юридического. В первом году был открыт только философский факультет.
В 1838 г. польское движение привело к временному закрытию университета и увольнению или переводу профессоров и студентов польского происхождения. Число слушателей сильно сократилось; половина кафедр опустела и была замещена потом русскими или немцами. В 1841 г., взамен упраздненной Виленской медико-хирургической академии, в Киевском университете был открыт медицинский факультет.
26 января 1850 г. университету было предписано принимать всего 300 "своекоштных", то есть обучавшихся за свой счёт, студентов (исключение было сделано только для Медицинского факультета). При этом предпочтение отдавалось тем кандидатам, которые, согласно с. 3. III тома Установления о службе гражданской имели право на вступление в гражданскую службу. В 1848—56 гг. были построены анатомический театр и метеорологическая обсерватория, начали свою деятельность комиссии для описания губерний Киевского учебного округа и для разбора древних актов.
По уставу 1863 г. в Киевском университете полагалось 58 профессоров и 31 доцент, а в университете насчитывалось только 35 профессоров и 5 адъюнктов, к тому же 12 профессоров не имели докторской степени. Для замещения кафедр университет создал институт стипендиатов (1864), принятый потом министерством народного просвещения и для других университетов. В научном отношении наиболее производительным был первый период, до 1848 г., отмеченный трудами Максимовича, Даниловича, Иванишева, Неволина, Кесслера, Миддендорфа и др.; затем ученая производительность профессоров сильна понизилась и оживилась только в 60-х годах. С этого времени (1861) начинают издаваться «Университетские Известия» и при них «Сборник сочинений студентов»; открывается ряд ученых обществ, пополняются библиотека и коллекции, которые до тех пор оставались почти в таком же виде, в каком были перевезены из Кременца и Вильно, учреждаются новые кабинеты и лаборатории, строятся здания химической лаборатории (1873) и клиник (1885).
В 1884 году университет праздновал 50-летний юбилей; происшедшие при этом студенческие волнения подали повод к закрытию университета на полгода. После открытия вновь университета был введен новый Устав 1884. Число слушателей в университете сильно колебалось, но в общем постоянно возрастало: университет открылся при 62 студентах, в 1838 г. было 267 студентов, после закрытия университета в 1838 г. — 125, к 1860 г. — 1049; в 1863 г., вследствие польского восстания, большая часть студентов-поляков оставила университет и число студентов упало до 476; в 1871 г. — 940, в 1876 г. — 613, в 1884 г. — 1709, в 1894 г. — 2327.
В конце XIX начале XX вв. при Киевском университете состоят: библиотека со студенческим отделом (более полумиллиона томов) и центральным архивом древних актов, 2 обсерватории — метеорологическая и астрономическая, 4 факультетских клиники, 3 госпитальных и 3 при городской Александровской больнице, анатомический театр, патологоанатомический институт, ботанический сад, 9 лабораторий и 22 кабинета. Университет издает ежемесячный журнал: «Университетские Известия». При университете 5 ученых обществ (историческое Нестора-летописца, естествоиспытателей, юридическое, физико-математическое и акушерско-гинекологическое).
В 1900 году студенты выступили в знак протеста против исключения из университета участников студенческого митинга, в результате которого 183 студента отдали в солдаты.
В ноябре 1910 года в Киеве состоялись бурные рабоче-студенческие демонстрации в связи со смертью Льва Толстого. Среди 107 арестованных демонстрантов — около сотни студентов. В феврале 1911 года опять состоялась всероссийская студенческая забастовка.
